1.مقدمه

بی تردید استفاده از پدیده های فیزیکی معمول ترین روش در سن سنجی وقایع زمین شناسی بوده و با کمک آن می توان ترتیب بسیاری از اتفاقات زمین شناسی و باستان شناسی را تعیین کرد. در بسیاری از مطالعات، سن و گذشته تاریخی نمونه های یافته شده را با استفاده از قرائن تاریخی موجود مانند نوع پادشاهی حاکم و غیره مشخص میکنند. پر واضح است که این روشها محدودیت و خطاهای فراوانی دارد و از این رو در باستان شناسی مدرن از تکنیکهای سن سنجی قطعی تر و مستقل تری استفاه می شود که از آن جمله می توان به سن سنجی با کربن 14 و پرتوزایی طبیعی نمونه اشاره کرد. در کنار این تکنیکها روش و تکنیک دیگری وجود دارد که نوپا است و بر خلاف سایر روشها اساس شیمیایی داشته و سن سنجی با اسید های آمینه (AAR) نام دارد. دقت در تعیین سن و قابلیت استفاده در علوم مختلف از جمله برتریهای این تکنیک نسبت به تکنیکهای مشابه است و بزرگترین نقطه ضعف آن فراهم کردن اطلاعات در حد مولکولی است و  نمی تواند مانند سن سنجی با رادیو کربن در سطح اتمی اطلاعاتی را فراهم کند.

   اسید های آمینه مولکولهای آلی کوچکی هستند که پروتئینها را می سازند. اگرچه تعداد زیادی اسید آمینه در طبیعت وجود دارد اما تنها در حدود 20 نوع از آنها در ساختمان پروتئینها بکار می روند. این واحدهای ساختاری زنجیر وار در کنار یکدیگر قرار می گیرند و توسط پیوندی به نام پیوند پپتیدی به یکدیگر متصل می شوند و به این ترتیب یک مولکول پروتئینی را می سازند. از لحاظ ساختاری هر اسید آمینه دارای یک اتم هیدروژن (H)، گروه آمین (NH2)، گروه کربوکسیل (COOH) و یک زنجیره جانبی (R) است که همگی به یک اتم کربن (کربن آلفا) متصل اند. در همه اسید های آمینه به جز گلیسین ریشه R ممکن است یک زنجیره کربنی و یا یک حلقه کربنی باشد. به جز اسید آمینه گلیسین که در آن زنجیره جانبی یک هیدروژن است،  در بقیه اسید های آمینه کربن آلفا یک کربن نامتقارن است به این معنی که به چهار مولکول مختلف متصل می باشد. چنین مولکولی کایرال نامیده می شوند. مطابق قرار داد اگر در ساختمان فضایی یک اسید آمینه عامل NH2 متصل به کربن آلفا در طرف چپ باشد، اسید آمینه نوع L  و هرگاه در طرف راست کربن آلفا قرار گیرد اسید آمینه از نوع D است

دو ساختار D و L تصویر ایینه ای (اناتیومر یا کایرال) یکدیگرند. مولکولهای کایرال یک اسید آمینه از لحاظ شیمیایی مشابه اند اما در مقابل نور قطبیده رفتار متفاوتی دارند. اسید آمینه L نور قطبیده را به صورت چپ گرد و اسید آمینه نوع D نور قطبیده را به صورت راستگرد می چرخاند. . اسیدهای آمینه طبیعی همگی از نوع L هستند. مجموعه آنزیمی موجود در سلول طی فرایند برگشت پذیر راسمیزاسیون دائما انواع D را به L تبدیل می کند. وقتی موجود زنده ای می میرد کنترل بر روی پیکربندی اسید های آمینه متوقف شده و اسیدهای آمینه نوع L به آرامی به نوع D تبدیل می شوند و مجددا به حالت اول باز می گردند .  به این ترتیب در نتیجه مرگ موجود زنده مقدار D تدریجا افزایش یافته و نسبت اسید ها آمینه D به L از صفر به سمت 1 حرکت می کند. با اندازه گیری نسبت D به L اسید های آمینه نمونه می توان زمان مرگ نمونه را تخمین زد. همه اسید های آمینه برای این منظور مناسب نیستند. برای مثال اسید آمینه گلیسین کایرال نیست و یا آلانین در نتیجه واکنشهای تجزیه ای در فسیل تولید می شود [1]. اسیدهای آمینه ای مانند سرین و ترئونین از نظر ترمودینامیکی ناپایدارند و طبیعتا نیمه عمر کمی دارند. به این ترتیب اسیدهای آمینه ای با سرعت راسمیزاسیون مناسب مانند ایزولوسین، لوسین، والین و گلوتامیک اسید و آسپارتیک اسید در مطالعات دیرین شناسی و سن سنجی مورد توجه اند [2]. 

روشهای شیمیایی سن سنجی از این جهت با تکنیک مبتنی با رادیواکتیو متفاوتند که تکنیکهای شیمیایی تحت تاثیر پارامترهای شیمیایی و محیطی قرار می گیرد. به عبارت دیگر سرعتی که در آن پروتئینها تجزیه شده و یا در اسید های آمینه آن راسمیزاسیون رخ می هد اساسا به ویژگیهای شیمیایی اسید آمینه، موقعیت قرار گیری اسید آمینه در پروتئین، دما و فاکتورهای محیطی محل دفن نمونه (pH، رطوبت ، مقدار کاتیون و آنیون و محتوی می محیط) وابسته است [3].  در زیر برخی از مهمترین عوامل موثر بر راسمیزاسیون اسیدهای آمینه آورده شده است.

2.عوامل موثر بر AAR

AAR شدیدا به دما حساس است [4]. بطوریکه سرعت واکنش برای هر چهار درجه افزایش دما دو برابر می شود. تصویر 2 اثر افزایش دما بر میزان راسمیزاسیون اسید آمینه ایزولوسین را در فسیل نرمتنان مدیترانه تا شمال اروپا نشان می دهد [4]. بعلاوه دمای موثر بر فرایند راسمیزاسیون تحت تاثیر کلیه دماهایی است که بر نمونه از زمان مرگ تا لحظه مطالعه اعمال شده است. برای فسیلی که نیمی از عمر خود را در دمای 0 درجه و نیمه دیگر را در 20 درجه سانتیگراد طی می کند و متوسط دمای محیط این فسیل 10 درجه سانتیگراد است میزان راسمیزاسیون مشابه با نمونه ای است که درکل مدت عمر در  7/16 بوده است [4]. به همین دلیل دما را به صورت دمای موثر در نظر می گیرند. دمای موثر (Teff) مقدار دمایی است که بتواند مقدار راسمیزاسیون محاسبه شده را ایجاد کند. برای نقاطی که نوسانات دمایی روزانه و فصلی آنها زیاد است، مقدار این پارامتر معمولا بیشتر از متوسط دمای اعمال شده بر سیستم است. 

مقدار pH سیستم عمیقاً بر راسمیزاسیون اسید های آمینه موثر است. مواد معدنی بیولوژیکی که در محلولهای با pH بالاتر از 9 حرارت دهی میشوند سریعتر از نمونه مشابه ولی در pH طبیعی راسمیزه می شوند [5]. برای مثال مقدار D/L اسید آسپارتیک در صدف نرمتنان با pH 10 ، 29% بیشتر از pH 7 است. میزان حذف اسیدهای آمینه از نمونه نیز با افزایش pH افزایش می یابد [6]. این یافته ها بر این حقیقت تاکید دارد که از این روش نمی توان برای سن سنجی نمونه های به شدت بازی استفاده کرد.

بین وزن مولکولی زنجیره پلی پپتیدی و میزان راسمیزاسیون اسید های آمینه آن رابطه معی برقرار است و این رابطه بیشتر به محل قرارگیری اسید آمینه در زنجیره مربوط است تا وزن مولکولی زنجیره. برای مثال میزان راسمیزاسیون ایزولوسین در قطعاتی با وزنهای کم مولکولی همواره بیشتر از یک قطعه با وزن مولکولی بالا است [7] .

انتقال فیزیکی اسیدهای آمینه به بیرون از بافت نمونه توسط یک فاز مایع ( معمولا آب) شستشو[1] نامیده می شود. سرعت شستشو توسط اندازه مولکول متحرک ، میزان چسبندگی آن به ماتریکس فسیل و قطر مسیر شستشو تعیین می شود [8]. مولکولهایی مانند اسید های آمینه آزاد و پپتیدهای کوچکی که در مسیر قرار دارند ( مولکولهایی با وزن مولکولی کم) نسبت به شستشو حساس اند. با توجه به اینکه اسیدهای آمینه ازاد سرعت راسمیزاسیون بالاتری دارند، شستشو سطح کلی راسمیزاسیون نمونه را کاهش می دهد. در مقابل اسیدهای آمینه ای که به صورت درون کریستالی در ساختار فسیلهای کربناتی شرکت می کنند نسبت به شستشو مقاومند. در حقیقت درون یک کریستال مانند یک سیستم بسته عمل کرده و اسید آمینه را از تغییرات محیطی حفظ می کند. ایزوله بودن درون کریستالها این امکان را فراهم می کند که با اعتبار بالایی از اسیدهای آمینه موجود در آنها برای سن سنجی نمونه استفاده شود [9و3].

3. کاربردها

الف) تعیین سن انسان

اسیدهای آمینه موجود در بافتهای زنده همگی از نوع L هستند و با مرگ موجود ارام ارام به نوع D تبدیل می شوند. تشکیل ساختار D اسیدهای آمینه در بخشهایی با متابولیسم ارام مانند استخوان، دندان، عدسی چشم و مغز ، شاخصی از زمان مرگ می تواند باشد [10و 11]. با استفاده از اندازه گیری نسبت D/L اسید اسپارتیک در پروتئینهای موجود در مینای دندان می توان زمان مرگ یک انسان را تعیین کرد چراکه پروتئینهای موجود در مینای دندان کمتر تحت تاثیر شرایط محیطی قرار می گیرند. معمولا در این تکنیک از GC یا کرماتوگرافی گازی استفاده می شود با اینحال روشهایی مانند HPLC و اسپکتروسکوپی فلورسانس نیز در این نوع از مطالعات دقت بالایی داشته و نتایج درستی فراهم می کنند. لازم به ذکر است که قابل اعتماد بودن نتایج این روش سن سنجی به نوع نمونه گیری، نگهداری و انالیز نمونه ها و داده ها بستگی دارد [12]. فاکتورهای متعددی می تواند راسمیزاسیون آسپارتیک اسید را تحت تاثیر قرار دهد که از آن جمله می توان به نوع دندان، محل نمونه برداری، و آنالیز پروتئینی نمونه اشاره کرد. روش سن سنجی انسان با استفاده ار راسمیزاسیون اسید های آمینه روشی سریع و قابل اعتماد است و تنها نیاز به استفاده از گرافهای کالیبراسیونی دارد که از گروههای مختلف سنی و با دوره های مختلف زمانی تهیه شده باشد [13].

استفاده از AAR در سن سنجی استخوان دارای محدودیتهایی است چراکه شرایط محیطی مانند دما و میزان رطوبت می تواند بر سرعت راسمیزاسیون اسید های آمینه موثر باشد. امروزه از این روش با دقت بسیاری برای تعیین سن استخوان استفاده می شود و این روش اطلاعات خوبی را در ژئوشیمی استخوان، دندان و پروتئینها فراهم می کند. بیشتر مطالعات بر روی استخوان در دمای بالا و وماً در یک سیستم بسته رخ می دهد اما استخوانهای باستانی در یک سیستم باز قرار دارند. ماتریکس استخوان منفذ دار است و بنابراین اسیدهای آمینه می توانند از آن خارج شوند و آلودگیها به آن اضافه گردند. برخی محققان بر این باورند که اگر استخوان در شرایط مناسبی حفظ شده باشد( با دانستن تاریخچه دما و شرایط آب و هوایی) می توان از آن برای سن سنجی استفاده کرد. در بسیاری از تحقیقات از درشت مولکولهای استخوانی مانند کلاژن برای سن سنجی استفاده می کنند [14]. لازم به ذکر است که این روش نیزدارای محدودیتهایی است چراکه کلاژن دارای ساختار سوم پیچیده بوده و در نتیجه چندان به راسمیزاسیون حساس نیست.

ب) تعیین سن نمونه های باستانی

مطالعات نشان داده اند که در صورتی که نمونه مورد مطالعه در مجاورت واکنشهای متابولیسمی قرار نگرفته باشد میزان اسید های آمینه بدون تغییر بوده و ارزش بیشتری برای مطالعات باستان شناسی دارد [11]. یکی از بهترین محیطهایی که در آن پروتئینها و اسید های آمینه حفظ شده باقی می مانند، اسکلتهای کربناتی بی مهرگانی مانند نرم تنان و یا بازوپایان است. مواد آلی به این اسکلتهای کربناتی اضافه شده که یا در میان بلورهای معدنی[2] آن قرار می گیرند و در شکل گیری صدف دخالت میکنند و یا اینکه به صورت درون کریستالی[3] قرار گرفته و انعطاف پذیری صدفها را موجب می شوند [11]. تقریبا تمامی مولکولهای پروتئینی که وارد این ساختارهای کریستالی می شوند از نوع L اسید های آمینه هستند. از لحظه ورود این اسید های آمینه به بافت کربناتی ساعت زمین شناسی آن نیز فعال می شود.  ارزیابی سایر نمونهای مطالعاتی مانند اسکلت ماهیها، چوب، استخوان، دندان و مرجانها نیز با این روش ممکن است [15]. همانطور که گفته شد عوامل محیطی مانند دما و میزان رطوبت و نیز مقدار اسید آمینه نمونه می تواند بر کارایی این تکنیک موثر باشد. اپیمریزاسیون ایزولوسین و راسمیزاسیون آسپارتیک اسید معمول ترین اسید های آمینه ای هستند که برای این منظور بکار می روند. برای مثال اسید آمینه آسپارتیک اسید دارای سرعت راسمیزاسیون بالایی است به این خاطر معمولا برای مطالعه نمونه های جوان و یا استخراج شده از مناطق به شدت سرد بکار می رود. اپیمریزاسیون ایزولوسین به آرامی صورت می گیرد و به همین دلیل بیشتر برای سن سنجی نمونه هایی با سن بیشتر از 20000 تا 200000 سال و دمای 24- درجه سانتیگراد مناسب اند [16]. در محیطهایی که دما از این مقدار کمتر باشد از ایزولوسین برای سن سنجی نمونه های قدیمی تر نیز می توان استفاده کرد. اما راسمیزاسیون آسپارتیک اسید سریع است و بیشتر برای مطالعه نمونه هایی با سن تقریبی چند هزار سال تا حد اکثر 80000 سال مناسب است.Goodfriend  و همکارانش در سال 1992 در یافتند که این اسید آمینه برای نمونه های 300 ساله نیز کاربرد دارد. در این حالت باید این تکنیک در کنار سایر تکنیکهای سن سنجی استفاده شود [17].

ج) تشخیص بیماریها و اختلالات

تکنیک سن سنجی نه تنها در تعیین سن نمونه های غیر زنده که در تاریخ گذاری و بررسی پیشینه نمونه های زنده و سابقه بیماری در انها نیز کاربرد دارد. مطالعات نشان داده اند که مطالعه بیوشیمیایی راسمیزاسیون اسیدهای آمینه در بیماریهای ماهیچه ای – اسکلتی از  اهمیت بسزایی دارد و بوسیله آن می توان زمان آغاز بیماری را سنجید [14]. غلظت اسیدهای آمینه D موجود در بافتها و اندامها در بیماریهای مختلف فرق می کندبرای مثال مطالعات chervyakov و همکارانش نشان دهنده نقش مهم اسیدهای آمینه  D در فرایند پیری و ایجاد بیماریهای مغزی مانند اایمر دارد []. همچنین D-اسپارتیل در بسیاری از بیماریهای مرتبط با کهولت سن شناسایی شده است. در جدول 1 برخی از بیماریهای مرتبط با اسیدهای آمینه D اورده شده است. بطور کلی امروزه مطالعه کمی و مقایسه ای اشکال D و L اسید اسپارتیک یک شاخص قدرتمند و قابل اعتماد در تشخیص بیماریهایی نظیر اایمر و آب مروارید است [19].

جدول1. تنوع اسیدهای آمینه D در بیماریهای وابسته به سن []

4. نتیجه گیری

شکل گیری اسیدهای آمینه نوع D در ارگانیزمها و بافتها شاخصی مفید در مطالعه و بررسی تغییرات، بیماریها و اختلالاتی است که در یک بافت رخ می دهد. امروزه از اندازه گیری مقدار تبدیل فرم L به D اسیدهای آمینه در باستان شناسی، پزشکی و پزشکی قانونی استفاده می شود. با کمک AAR به سادگی می توان سن نمونهای زمین شناسی و باستانی را تشخیص داد و بعلاوه با کمک گرافهای کالیبراسیون ، شرایط اب و هوایی حاکم بر زمان مرگ نمونه ها را نیز مشخص کرد. بعلاوه این تکنیک اطلاعات ارزشمندی را برای محققان و کاراگاهان در کشف جنایات فراهم کرده و به افزایش دقت در تشخیص مجرمان کمک می کند. روش انجام ازمایشها معمولا با کمک ابزارهای کروماتوگرافی صورت میگیرد. بدیهی است که پیشرفت تکنیکهای کروماتوگرافی می تواند دقت داده های سن سنجی با اسیدهای آمینه را افزایش دهد.

5. منابع

[1] Devièsea, T., Karavani, I., Comeskeya, D., Kubiaka, C., Korlevi, P. Direct dating of Neanderthal remains from the site of Vindija Cave and implications for the Middle to Upper Paleolithic transition, PNAS, 2017, pp. 1-6.

[2] Hassan, Q., Rakha, A., Bashir, M.Z . Aspartic Acid Racemization with Correlation to Age: A Forensic Perspective, Journal of the College of Physicians and Surgeons Pakistan, 2017, (5),pp. 283-287

[3] Penkman, K.E.H ., Precee, R.C., Keen, D.H.,Collins, M.J . Amino acid geochronology of the type Cromerian of West Runton, Norfolk, UK. Quaternary International ,2010, pp.228:25-37

[4] Miller GH, Hart CP, Roark EB And, and Johnson BJ. Isoleucine Epimerization in Eggshells of the Flightless Australian Birds, Genyornis and Dromaius. In: Goodfriend GA, Collins MJ, Fogel ML, Macko SA, and Wehmiller JF (eds.) Perspectives in Amino Acid and Protein Geochemistry, New York: Oxford University Press.2000.

[5] Bright J and Kaufman DS . Amino acids in lacustrine ostracodes, part III: Effects of pH and taxonomy on racemization and leaching. Quat.Geochronol6, 2011a, pp. 574–597.

[6] Orem C.A., Kaufman D.S. Effects of basic pH on amino acid racemization and leaching in mollusk shell. Quat.Geochronol 2011, pp. 233–245.

[7] Rebeccah  A., Warma ck,  Clarke G. Racemized and Isomerized Proteins in Aging Rat Teeth and Eye Lens, REJUVENATION RESEARCH Volume 19, Number , 2016, pp. 309-317.

[8]  Garde E., Frie A., Dunshea G.,  Hansen S., Harp seal ageing techniques—teeth, aspartic acid racemization, and telomere sequence analysis, Journal of Mammalogy ,2010, pp.1365-1374.

[9] Bright J ., Kaufman D.S Amino acid racemization in lacustrine ostracodes, part I: Effect of oxidizing pre-treatments on amino acid composition. Quate.Geochronol , 2011b,pp. 154–173.

[10] Baumgart F, Rodríguez-Crespo I. D-amino acids in the brain: the biochemistry of brain serine racemase. FEBS J. 2008,275(14).pp.3538-45.

[11] Klumb K, Matzenauer C, Reckert A, Lehmann K, Ritz-Timme S. Age estimation based on aspartic acid racemization in human sclera., Int J Legal Med. 2016,130(1).pp.207-11.

[12] Dobberstein, R.C,. Huppertz, J., vonWurmb-Schwark, N., Ritz-Timme, S. Degradation of biomolecules in artificially and naturally aged teeth: Implications for age estimation based on aspartic acid racemization and DNA analysis. Forensic Sci. Int. 2008, 179. pp. 1–191.

[13]  Kumar, K.Dental age estimation using amino acid racemization, Indian journal of dental research,2008,19 pp. 172-174

[14] Kalíková, K., lechtová, T., Tesaˇrová, E. Enantiomeric Ratio of Amino Acids as a Tool for Determination of Aging and Disease Diagnostics by Chromatographic Measurement , Separations, 2016, 3pp.30- 35.

[15] Kosnik M.A.,Kaufman D.S .Identifying outliers and assessing the accuracy of amino acid racemization measurements for geochronology: II. Data screening. Quaternary Geochronol, 2008, 3(4).pp. 328–341.

[16] Dietl G,P.,Flessa K,W.Conservation paleobiology: Putting the dead to work. Trends in Ecol. Evol, 2011, 26.pp. 30–37.

[17] Goodfriend . Rapid racemization of aspartic acid in mollusc shells and potential for dating over recent centuries. Nature, 1992, 357.pp.399–401.

[] Chervyakov, A.V., Gulyaeva, N.V., Zakharova, M.N. D-amino acids in normal ageing and pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem. J. 2011, 5.pp.100–114.

[19] Fujii, N., Takata, T., Fujii, N., Aki, K. Isomerization of aspartyl residues in crystallins and its influence upon cataract. Biochim. Biophys. Ac

[1] Leaching

[2] Intercrystalline

[3] Intracrystalline

پرتوهای رادیواکتیو

self organization یا self assembly

سن سنجی با کمک اسیدهای آمینه